Region Puszczy Białowieskiej obejmuje obszar położony na pograniczu Polski i Białorusi.
Granice regionu nie są ściśle wytyczone administracyjnie, ponieważ Puszcza stanowi obszar przyrodniczy o charakterze naturalnym i historycznym.
Od strony zachodniej i północnej: region graniczy z innymi częściami Niziny Podlaskiej oraz z terenami rolniczymi i leśnymi o mniejszym stopniu naturalności.
Od strony południowej i wschodniej: granicę wyznacza państwowa granica Polski z Białorusią, która dzieli Puszczę na część polską i białoruską.
Na południu region sięga obszarów wokół miejscowości Hajnówka i Narewka.
Na terenie Polski: Region Puszczy Białowieskiej sąsiaduje z innymi kompleksami leśnymi i terenami rolniczymi województwa podlaskiego, takimi jak Puszcza Knyszyńska na północnym zachodzie oraz obszary rolnicze Doliny Narwi.
Na terenie Białorusi: obszar sąsiaduje z Parkiem Narodowym „Białowieski” (Belovezhskaya Pushcha), który jest kontynuacją lasu pierwotnego i stanowi jedną z głównych części ochronnych.
Region Puszczy Białowieskiej to transgraniczny obszar o wyraźnych granicach naturalnych, obejmujący największy w Europie pierwotny las nizinny. Jego sąsiedztwo tworzą obszary leśne o mniejszej naturalności, tereny rolnicze oraz obszary ochrony przyrody po obu stronach granicy państwowej Polski i Białorusi.